유전자 분석은 Genomic DNA 추출, 중합효소연쇄반응(PCR), 서열 판독(Sequencing) 등 크게 3단계로 구분할 수 있다. 첫 번째인 Genomic DNA 추출은 곤충체세포 내에서 total DNA를 추출하는 과정으로 크게 마쇄법과 침지법으로 구분할 수 있다. 마쇄법은 표본(샘플)을 마쇄기로 분쇄하여 가루를 내어 세포용혈완충용액(Lysis buffer)과 단백질분해효소(Proteinase K)에 노출시켜 추출하는 방법으로 표본의 손상이 있을 수 있다. 침지법은 표본을 통째로 세포용혈완충용액과 단백질분해효소에 노출시키는 방법으로 표본의 손상이 거의 없는 방법이다.

 

마쇄법과 침지법의 비교

	마쇄법	침지법
방법	분쇄 후 완충용액과 단백질분해효소에 노출	표본을 통째로 완충용액과  단백질분해효소에 노출
소요시간	1-3시간	24시간
장점	Genomic DNA 추출 농도가 높음	표본이 손상되지 않음
단점	표본이 손상됨	Genomic DNA 추출 농도가 낮음

 

중합효소연쇄반응(PCR)은 분석하고자 하는 유전자 좌위를 증폭시키는 단계로 특정 프라이머(Primer)를 사용하여 원하는 유전자를 증폭시킬 수 있다. 이 과정은 중합효소연쇄반응유도기(PCR cycler) 크게 개시 단계, 신장 단계, 종결 단계 등 3개의 단계가 반복하면서 일어나는 과정으로 개시 단계에는 주형 DNA 가닥에 프라이머가 부착되는 단계이며, 신장 단계는 프라이머를 시작점으로 DNA 서열이 복제되는 단계이고, 종결 단계는 복제된 DNA 가닥이 주형으로부터 분리되는 단계이다. 이 3가지 단계를 30-40회 반복하면서 서열이 증폭된다.

 

 

 

 

중합효소연쇄반응유도기(PCR Cycler)

 

 

마지막으로 서열 판독(Sequencing)은 현재 Auto-Sequencer라고 하는 서열 판독기를 이용하여 수행할 수 있다. 서열 판독기를 가동하기 전, Sequencing PCR 단계를 수행하는데, 이는 단일 방향 프라이머만을 사용하여 서열을 증폭하는 방법으로 앞선 중합효소연쇄반응 단계와는 프라이머의 첨가 방법 등 수행 방법에 있어 차이가 있다. Sequencing PCR 후 얻어진 산물은 서열 판독기를 통해 판독될 수 있으며, 판독된 서열을 이용하여 유전자 서열 분석을 수행할 수 있다.

 

 

 

서열 판독기(Auto Sequencer)

 

 

유전자 서열 분석은 주로 MEGA (The Molecular Evolutionary Genetics Ananlysis software)라는 유전자 분석 프로그램을 기반으로 수행된다. 확보된 곤충 유전자 서열을 프로그램 상으로 불러들여 서열간 차이를 비교/분석하는 것으로 유전자 서열 비교/분석 시 유전자 진화 모델을 기반으로 분석한다. 종간 분석 시 사용되는 유전자 진화 모델은 Kimura-2-parameter이며, 이를 기초로 하여 종간의 서열 분석이 실시될 수 있다.

 

1.     MEGA 프로그램 실행

 

2.     분석 서열 열기

 

 3.     분석할 서열을 불러들인 화면

 

4.     MEGA에 내장된 ClustalW 서열 정렬 프로그램을 이용하여 분석 서열 정렬 

 

 

5.     ClustalW 프로그램을 이용하여 분석서열을 정렬하는 모습

 

6.     분석을 위해 정렬된 서열을 MEGA format으로 저장

 

7.     MEGA format으로 저장된 서열 Data를 열기

 

8.     MEGA format의 서열 Data를 불러들인 모습

 

 9.     불러들인 MEGA format 서열 Data를 이용하여 서열차이분석: 서열차이에 기초한 종동정

 

10.  서열 차이 분석을 위한 옵션 설정: Model을 선택하여 Nucleotide의 Kimura 2-Parameter 선택 후 Compute를 클릭

 

11.  서열차이분석을 통해 얻어진 분석표: 개체 및 종간 서열차이를 나타냄

 

12.  불러들인 MEGA format 서열 Data를 이용하여 표현도 분석: 표현도에 기초한 종동정

 

13.  표현도 분석을 위한 옵션 설정: Model을 선택하여 Nucleotide의 Kimura 2-Parameter 선택 후 Compute를 클릭

 

14.  표현도 분석을 통해 얻어진 표현도: 각각의 가지에 개체 및 종간 서열 차이가 반영됨

 

 

 

 

유전자 서열분석 후 종동정은 서열차이에 기초한 종동정(Sequence Divergence Approach)과 표현도(Phenogram)에 기초한 종동정(Clade-based Approach) 등 크게 2가지 방법이 사용될 수 있다. 서열차이에 기초한 종동정은 Barcoding gap의 유/무를 통해 동정하는 방법으로 Barcoding gap은 종내최대서열차이(Intraspecific Sequence Divergence)와 종간최소서열차이(Interspecific Sequence Divergence) 사이에 형성되는 일련의 서열차이의 공간이라고 할 수 있으며, 이 공간의 존재 여부를 통해 종을 동정하는 방법이다. 두 번째로 표현도에 기초한 종동정은 서열차이를 분석한 유전자들을 이용하여 계통수 형태의 표현도를 만들어 Barcoding gap에 기초하여 묶여지는 묶음(species cluster)을 기반으로 종동정을 수행하는 것을 말한다. 이 표현도는 앞선 방법인 서열차이에 기초한 종동정에서의 서열차이를 기반으로 만들어지는 것이기 때문에, 표현도의 가지(Branch)가 서열차이를 반영하고 있다.